alkov.su

Как проверить гемоглобин: методы определения гемоглобина

Гемоглобин, его функции и соединения. Методы определения.

Гемоглоби́н (от др.-греч. αἷμα— кровь и лат. globus — шар) — сложный железосодержащий белок кровосодержащих животных, способный обратимо связываться с кислородом, обеспечивая его перенос в ткани. У позвоночных животных содержится в эритроцитах, у большинства беспозвоночных растворён в плазме крови (эритрокруорин) и может присутствовать в других тканях.

Главная функция гемоглобина состоит в переносе кислорода. У человека в капиллярах лёгких в условиях избытка кислорода последний соединяется с гемоглобином. Током крови эритроциты, содержащие молекулы гемоглобина со связанным кислородом, доставляются к органам и тканям, где кислорода мало; здесь необходимый для протекания окислительных процессов кислород освобождается из связи с гемоглобином. Кроме того, гемоглобин способен связывать в тканях небольшое количество диоксида углерода (CO2) и освобождать его в лёгких. Монооксид углерода (CO) связывается с гемоглобином крови намного сильнее( почти в 500 раз), чем кислород, образуя карбоксигемоглобин (HbCO). Некоторые процессы приводят к окислению иона железа в геме до степени окисления +3. В результате образуется форма гемоглобина, известная как метгемоглобин (HbOH) (metHb, от мета… и гемоглобин, иначе гемиглобин или ферригемоглобин, см. Метгемоглобинемия). В обоих случаях блокируются процессы транспортировки кислорода. Впрочем, монооксид углерода может быть частично вытеснен из гема при повышении парциального давления кислорода в легких.

Нормальным содержанием гемоглобина в крови человека считается: у мужчин 130—170 г/л (нижний предел — 120, верхний предел — 180 г/л), у женщин 120—150 г/л; у детей нормальный уровень гемоглобина зависит от возраста и подвержен значительным колебаниям. Так, у детей через 1—3 дня после рождения нормальный уровень гемоглобина максимальный и составляет 145—225 г/л, а к 3—6 месяцам снижается до минимального уровня 95—135 г/л, затем с 1 года до 18 лет отмечается постепенное увеличение нормального уровня гемоглобина в крови.

Тест на знание английского языка Проверь свой уровень за 10 минут, и получи бесплатные рекомендации по 4 пунктам:

    Аудирование Грамматика Речь Письмо

Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Из “старых” методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает

30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.

Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые данные не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин: конечный продукт превращения гемоглобина – HbN3 имеет слабый пик поглощения при l = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами; иногда возникают проблемы, связанные с мутностью растворов; и наконец, раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре. Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.

Узнай стоимость написания работы Получите ответ в течении 5 минут . Скидка на первый заказ 100 рублей!

Интерференция при всех колориметрических методах анализа

Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х109/л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).

– Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО.

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Гемиглобинцианидный метод, разработанный в 1936 г Драбкиным, был одобрен Международным Комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г.

Экспериментальное изучение данного метода для его стандартизации в гемиглобинометрии имело следующие главные цели: найти точное значение коэффициента молярной экстинкции для HbCN при l = 540 нм; разработать требования для получения калибровочного раствора HbCN, обеспечивающие его стабильность в течение нескольких лет; усовершенствовать процедуру анализа при определении гемоглобина для снижения экспериментальных ошибок; оценить надежность других методов в сравнении с гемиглобинцианидным. На основе широкомасштабных исследований был определен коэффициент молярной экстинкции гемиглобинцианида, равный 11,00 (e540 = 11,00), и выработаны требования к его качеству.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

– HbCN является стабильным производным гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;

– спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при l = 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

– растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при l = 540 в широком диапазоне концентраций;

– калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Как проверить гемоглобин: методы определения гемоглобина

Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).

Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.

Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.

Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.

Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.

Читать еще:  Как поднять гемоглобин ребенку

Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.

Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.

Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.

Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку

Рис. Гемоглобинометр Сали.

С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.

Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.

Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.

Вид животного

Средний показатель в % Сали

Колебания

В 100 мл крови в г

Фамилия автора

Крупный рогатый скот.

80—110

C. Хрусталев
С. Смирнов
Ф. Михайлов
Баранов

C. Веремейчик

Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).

Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.

Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.

Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.

Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.

Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.

У животных определение цветного показателя проводится по формуле:

Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1

Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2

Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.

Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).

Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:

75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9

Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.

Гемоглобин единицы измерения

Методы измерения гемоглобина в крови

У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:

  • женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
  • мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.

Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.

Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

  • сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
  • недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B1 2);
  • заболевание красного костного мозга.

Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

  • повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
  • компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
  • снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.

Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.

Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:

После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.

Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.

Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.

Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи

Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.

Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.

У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.

Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.

Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).

Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.

Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!

С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).

Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.

Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.

Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.

В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.

Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.

Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).

  • А%=Х
  • Х=А×100/16,7
  • Х – определяемый показатель,
  • А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
  • 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.

Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:

  • Оксигемоглобин;
  • Дезоксигемоглобин;
  • Карбоксигемоглобин;
  • Метгемоглобин.

Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.

Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.

Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.

  • Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
  • Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
  • Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
  • Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.

Способы определения количества гемоглобина. 1193

Для измерения содержания гемоглобина существует много методов:

· определение количества связанного 02 (1 г Нb может присоединить до 1,36 мл О2);

· анализ уровня железа в крови (содержание железа в гемоглобине составляет 0,34%);

· колориметрия (сравнение цвета крови с цветом стандартного раствора);

· измерение экстинкции (спектрофотометрия) – ослабления света при распространении в среде за счет процессов поглощения и рассеяния.

При проведении рутинных определений уровня гемоглобина отдают предпочтение последнему методу, так как при использовании первых двух способов необходима сложная аппаратура, а метод колориметрии неточен.

Измерение количества гемоглобина методом спектрофотометрии: кровь набирают в капиллярную пипетку и затем смешивают с раствором, содержащим калий железосинеродистый , цианистый калий и бикарбонат натрия. Под действием этих веществ эритроциты разрушаются, и гемоглобин превращается в цианметгемоглобин (содержащий трехвалентное железо), способный сохраняться в течение нескольких недель. При спектрофотометрии раствор цианметгемоглобина освещают монохроматическим светом с длиной волны 546 нм и определяют экстинкцию. Зная коэффициент экстинкции и толщину слоя раствора можно, исходя из закона Ламберта-Бэра, определить концентрацию раствора непосредственно по величине экстинкции. Чаще предпочитают, однако, предварительно откалибровать шкалу экстинкции при помощи стандартного раствора. В настоящее время цианметгемоглобиновый метод считается наиболее точным из общепринятых способов измерения содержания гемоглобина.

Измерение количества гемоглобина колориметрическим методом (хотя этот метод и неточен, требуется его знание для сдачи зачета)): по классической методике Сали, исследуемую кровь смешивают в градуированной пробирке с определенным количеством соляной кислоты. При этом происходит гемолиз, превращение гемоглобина в солянокислый гематин и образование прозрачной жидкости темно-коричневого цвета. Пробирку помещают в колориметр-гемометр Сали и добавляют по каплям дистиллированную воду, пока цвет раствора в пробирке не станет таким же, как цвет стандартного раствора солянокислого гематина. При этом уровень жидкости в пробирке указывает на шкале величину содержания гемоглобина в исследуемой крови. Методика Сали очень проста, но дает большую погрешность (до 30%).

11. Цветовой показатель крови: величина, способ вычисления, клиническое значение.

ЦП – количественная оценка соотношения между эритроцитами и гемоглобином. ЦП крови характеризует степень насыщения одного эритроцита гемоглобином и рассчитывается по формуле:

где Нb(%) – содержание гемоглобина в крови, выраженное в процентах к условной «идеальной норме» 167 г/л;

Ег(%) – содержание эритроцитов в крови, выраженное в процентах к условной «идеальной норме» 5 х 10 12 /л.

На практике используют упрощенную формулу:

Норма цветового показателя 0,85-1,05, что соответствует нормальному содержанию гемоглобина в одном эритроците (нормохромия).

Увеличение ЦП означает, что насыщение эритроцитов гемоглобином повышено (гиперхромия), что бывает, например, при В12-дефицитной анемии (когда сильно тормозится деление эритроцитов, и резко уменьшается их содержание в крови, а синтез гемоглобина снижается в меньшей степени). Как физиологическое явление повышение ЦП наблюдается у лиц, проживающих в условиях высокогорья (ускорение синтеза гемоглобина при этом «обгоняет» усиление эритропоэза).

Уменьшение ЦП (снижение насыщение эритроцитов гемоглобином – гипохромия) наблюдается, например, при железодефицитной анемии, когда синтез гемоглобина тормозится в большей степени, чем эритропоэз.

Определение гемоглобина

2.3.1 Унифицированный метод определения количества гемоглобина на гемоглобинометре фотометрическом портативном МиниГЕМ

Принцип метода: Основан на превращении гемоглобина в цианметгемоглобин при добавлении к крови реактива (р-р Драбкина). Под влиянием железисто – синеродистого калия гемоглобин окисляется до метгемоглобина (гемоглобина), который затем превращается при помощи калия в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид).

Реактивы: 1) Трансформирующий р-р

Устройство: Гемоглобинометр МиниГЕМ 540 представляет собой специализированный фотометр, предназначенный для определения общего гемоглобина крови гемиглобинцианидным ме­тодом с фотометрированием на длине волны 540 нм.

Диапазон измеряемой прибором оптической плотности составляет от 0 до 0,9. Б, что соответствует концентрации общего гемоглобина крови от 0 до 360 г/л. В приборе используется стандартная проб подготовка – 20 мкл крови, разведение 1:250. Суммар­ная погрешность определения гемоглобина (с учетом погрешностей дозаторов и по­грешностей биохимического метода), полученная при сравнительных медицинских испытаниях, не превышает 2% (коэффициент вариации) во всем диапазоне измеряе­мых концентраций. При этом собственная погрешность гемоглобинометра как фото­метра – не более 1%, а воспроизводимость, оцененная по коэффициенту вариации, – не более 0,25%.

Два фактора обеспечивают это качество прибора:

высокая воспризводимость характеристик раствора гемиглобинцианида, который сохраняет свои свойства при надлежащем хранении долгие годы, в т. ч. коэффициента пересчета оптической плотности в концентрацию гемоглобина (или фактора калиб­ровки);

конструкция гемоглобинометра МиниГЕМ 540 обеспечивает высокую надежность фотометрических параметров прибора. МиниГЕМ 540 снабжен функцией саморегули­рования, он обладает многолетней стабильностью измерений.

Другая отличительная особенность гемоглобинометра – полностью автоматизирован­ная процедура фотометрирования.

Для определения гемоглобина достаточно опустить кювету с фотометрической про­бой в прибор, и через мгновенье на дисплее отобразится значение концентрации. Пере­счет оптической плотности раствора в концентрацию производится автоматически. Перед измерением прибор не нужно включать, “прогревать”, подстраивать или калибровать. Гемоглобинометр автоматически выключится при вынимании кюветы до следующего из­мерения.

Третья особенность гемоглобинометра МиниГЕМ 540 – его портативность и низкое энергопотребление.

Масса прибора без батарей не превышает 300 г. Питание от сети че­рез адаптер или от встроенных батарей. Ресурс батарей – 1 000 000 измерений, или 4 года работы.

Для контроля работоспособности гемоглобинометра используется контрольная стек­лянная мера, паспортизованная для каждого прибора. Внутрилабораторный и внешний контроль качества может проводиться с помощью обычных контрольных материалов -контрольных растворов гемоглобина.

подготовить пробирки, поместив в каждую из них по 5 мл трансформирующего рас­твора (раствор Драбкина);

во время взятия крови в каждую пробирку перенести по 20 мкл капиллярной крови( 0,02 мл пипеткой Сали) и тщательно перемешать раствор;

через 20 мин каждую пробирку перед измерением перемешать путем переворачивания пробирки вверх вниз (время лизирования) и провести серию измерений:

Учет результата:

перелить в оптическую кювету реакционную смесь из очередной пробирки;

опустить оптическую кювету в фотометрическую ячейку прибора, при этом автома­тически произойдет фотометрирование реакционной смеси, сопровождаемое звуко­вым сигналом, и на индикаторе появится число, соответствующее концентрации гемоглобина;

записать результат измерения.

2.3.2 Унифицированный метод определения концентрации гемоглобина на мини -фотометре MF-1020

Введение: мини фотометры являются миниатюрными настольными приборами для измерения гемоглобина крови.

Особенности прибора: цифровой индикатор, кювета открытого типа, относительная устойчивость к светорассеиванию, двухканальная оптическая схема.

Прибор показывает концентрацию гемоглобина в г/л. Светопоглощение зеленого света с длиной волны(546 нм) раствором гемиглобинцианида напрямую переводятся в единицы измерения гемоглобина. Настройка и калибровка прибора осуществляется при помощи двух ручек – « ZERO» и «CAL» . К прибору прилагается светофильтр (калибратор), назначение которого – убедиться в исправности оптических и электронных узлов и калибровки минифотометра.

Масса прибора 1 кг 300 гр.

2.В течение 10 мин прогрейте.

3.Убедитесь в том, что прибор правильно откалиброван.

4.Установите кювету с холостой пробой реагента трансформирующего раствора. 5.С помощью ручки « ZERO» на цифровом индикаторе установите нулевое значение. 6.Приготовьте кровь, разбавив ее 1:251 с трансформирующим раствором и проведите измерение.

1 .Двадцать микрометров крови (0,02 мл) необходимо разбавить в 5 ,0 мл трансформирующего раствора р-ра Драбкина- 1:21

2.Хорошо перемешайте (встряхните). Прежде чем приступить к измерению, подождите 5-10 мин, особенно если реагент не содержит детергент.

Калибровка минифотометра по стандартному р-ру гемиглобинцианида

Вставьте кювету, содержащую трансформирующий реактив (р-р Драбкина) в кюветный отсек.

При помощи ручки « ZERO» установите нулевое значение в цифровом табло.

Вставьте кювету, содержащую стандартный р-р гемиглобинцианида, в кюветный отсек.

При помощи ручки « CAL» установите данное значение стандартного калибровочного р-ра в цифровом табло (пример 150 г/л).

Повторите процедуру калибровки от пункта 1 до пункта 4.

Калибровка окончена, и Вы можете приступить к измерению

Калибровка минифотометра при помощи калибратора (по фактору)

1.Вставьте калибратор со светофильтром в кюветный отсек таким образом, чтобы была

видна надпись «ZERO» с цифровым значением (например, 0.1.6)

2.При помощи ручки «ZERO» установите это значение (п.п.0.1.6) в цифровом табло.

3.Переверните калибратор и вставьте его в кюветный отсек таким образом, чтобы

была видна надпись «CAL» с калибровочным значением (пример 159).

4.При помощи ручки «CAL» установите данное значение на цифровом табло.

Повторите процедуру от пункта 1 до пункта 4.

Калибровка окончена, и Вы можете приступать к измерениям.

Требования к реактивам:

1.Любая модификация р-ра пригодна для применения.

2.Разбавление 10 мкл крови в 2,5 мл трансформирующего не пригодно для этой модели.

3.Можно приготавливать самим р-р-1 раз в месяц, хранится в посуде из темного стекла.

2.3.3 Унифицированный метод определения гемоглобина на фотоэлектроколориметре

Принцип метода: Гемоглобин, взаимодей­ствуя с ацетонциангидрином, в присутствии железосинеродистого калия K3[Fe(CN)6] образует гемиглобинцианид красного цвета, интенсивность окраски которого пропор­циональна содержанию гемоглобина в пробе крови.

Реактивы: 1) трансформирующий раствор (0,5 мл ацетонциангидрина, 0,2 г железосинеродистого калия, 1 г гидрокарбоната натрия NaHCb растворяют в 1 л дистил­лированной воды; реактив стоек, хранится в посуде из темного стекла); 2) стандартный раствор гемиглобинцианида (раствор, выпускаемый фирмой «Ренал», содержит 59,75 мг% гемиглобинцианида; раствор фирмы «Иммуна» —64,23 мг%. Это соответствует концентрации гемоглобина в крови 150 и 154 г/л при разведении ее в 251 раз).

Ход определения. К 5мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл (капилляр Сали) крови. При этом кровь разводится в 251 раз. Оставляют пробирки на 20 мин при комнатной температуре.

Фотометрируют при зеленом светофильтре (длина вол­ны 540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм (1 см) против дистиллированной воды.

Стандартный раствор фотометрируют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Расчет. Содержание гемоглобина определяют по калибровочному графику, который строится по стандар­тному раствору гемиглобинцианида или по формуле:

Где С- концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л

Ео – оптическая плотность опытной, ед. опт. Плотность

Ек- оптическая плотность калибровочной пробы, ед.плот.

120-концекнтрация гемоглобина кВ калибровочном растворе, г/л.

Приготовленные разведения фотометрируют. против дистиллированной воды («холостая» проба).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9640 – | 7393 – или читать все.

95.47.253.202 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector